生物纳米颗粒的高速分析和高活性分选

2019-11-23 10:35:51

                                                     生物纳米颗粒,比如病毒以及细胞外囊泡(EVs),作为医学生物标志物以及疾病进展的调节剂备受关注,参考Journal of Extracellular 

                                                Vesicles杂志的影响因子就可见一斑,2018年的影响因子已经飙升到11,然而外泌体以及较小的病毒颗粒由于直径较小,在流式图上往往

                                                与背景噪音重合,而无法被传统流式所检测,为了从单个颗粒水平鉴定和分选,从而研究不同亚群的EVs,以美国国家癌症中心疫苗研究所

                                                (NCI Vaccine Branch)专家为首的研究人员推荐了一种纳米流式分析和分选方法(定义为nanoFACS),从而实现了EVs的高速度

                                                (>70000 events/s)、高纯度(>95%)、高特异性和高活性分选,其高活性体现在分选后的EVs保留了完整的形态,表面蛋白特性以及

                                                   所携带的RNA cargo活性



一、EVs研究,合适流式细胞仪的寻找(作者心目中)


                                              由于EVs直径较小,外泌体甚至低于150nm,传统基于石英杯激发(jet-in-cuvette)的流式分选仪器散射光检测极限都在200nm,

                                        所以作者认为灵敏度更高的流式仪器是基于空气式激发(jet-in-air),因此选择了市面上散射光分辨率能达到100nm的4种流式仪器,包

                                        括Partec CyFlow、BD Influx with SPD(SPD为FSC small particle detector ,即小颗粒检测模块)和贝克曼Moflo XDP(NanoView

                                        即小颗粒检测模块)以及Moflo Astrios EQ,考虑到下表对比中Moflo Astrios EQ所具备的超高分辨率以及拥有的极速电子处理系统,最

                                        后作者选取了Moflo Astrios EQ作为nanoFACS 方法学中EVs分析和分选的流式设备

生物纳米颗粒的高速分析和高活性分选(图1)

二、nanoFACS仪器的设定


                                                        1. 仪器配置:5激光MoFlo Astrios EQ (355, 405, 488, 561 and 640 nm);40nm鞘液过滤器;具备405, 488, 561 和 640 nm激光的SSC检测器模块

                                                        2. 前向检测器的调节:如为双前向仪器,去除dual-PMT beam splitter 和ND滤片,前向插上P1 mask

                                                        3. 仪器获取设置:阈值triggering threshold设置在561nnm 激光的SSC通道,数据分析使用488nm激光的SSC通道

                                                        4. 仪器分选设置:drop drive frequency 70–95 kHz, plate voltages 3000–4000 V以及relatively low amplitudes 8–15 V

                                                        5. Reference noise 设置:仪器的背景噪音,一部分源于激光和液流正交时散射光中未被bar挡掉的一部分折射光,如下图,作为nanoFACS方法中的一个重要助手,作

                                                            者认为设置为仪器最大上样速度的10–20%比较合适,可以更好分辨小颗粒

生物纳米颗粒的高速分析和高活性分选(图2)




三、实验结果呈现


1. 最佳阈值设置通道的选择


                                                通常我们做常规细胞实验,散射光阈值通道设置都会选择488nm激光FSC或SSC,一方面是市面流式在散射光阈值设置通

                                         道上只提供488nm激光的FSC和SSC,另一方面是因为对于足够大的细胞来说已经足够,而对于EVs来说,由于颗粒太小,

                                         为了获得EVs与背景噪音更好的分辨率,MoFlo Astrios EQ提供了不同激光的SSC作为阈值设置通道,下图b为阈值通道分

                                        别设置在488nm激光的SSC、561nm激光的SSC以及488nm荧光通道下100nm微球与背景噪音的分离指数,图知561nm

                                        激光SSC作为阈值设置通道为最佳,其最后结果图如图a,分群非常清晰


生物纳米颗粒的高速分析和高活性分选(图3)


2.CFSE标记的EVs分析检测



为了检测纳米流式MoFlo Astrios EQ在生物来源纳米颗粒的检测能力,作者用CFSE标记DC细胞来源的 (DC2.4) EVs,上流式检测如下图,

可见绝大部分的EVs能够与背景噪音明显区分,CFSE标记后的EVs在荧光和散射光二维图上则更为明显


生物纳米颗粒的高速分析和高活性分选(图4)

作者同时借助计数微球对以上EVs进行计数,下图e为粒度仪(Nanoparticle tracking analysis)下的EVs直径分布,图f为MoFlo Astrios

 EQ(5个重复样)和粒度仪(3个重复样)得出的EVs浓度相关性,表明MoFlo Astrios EQ与粒度仪的结果一致性较高

生物纳米颗粒的高速分析和高活性分选(图5)

3. 肿瘤和免疫细胞来源的EVs高速分选

作者下一步借助 CFSE 和Cell-Trace violet 染色,评估MoFlo Astrios EQ高速分选EVs的能力,标本为免疫细胞 (DC2.4, immature 

mouse dendritic cells) 和肿瘤细胞系 (4T1, mouse mammary carcinoma) ,下图d和e分别通过WB和粒度仪验证了DC2.4和4T1细

胞来源的EVs蛋白表达和粒径分布,图f则借助电镜观察了分选前DC2.4来源EVs的形态,以上实验均是验证分选前的样本中EVs的存在

生物纳米颗粒的高速分析和高活性分选(图6)



通过Cell-Trace Violet 标记的DC2.4 EVs 和 CFSE标记的4T1 EVs 经过混合后通过流式的纯度模式分选,分选速度为75,000 events/s

其设门逻辑如下


生物纳米颗粒的高速分析和高活性分选(图7)

通过流式检测后如下图a,EVs与背景噪音区分明显,图b上方为分选前的背景噪音和混合的EVs,图b下方则为分选后的DC2.4 EVs 和4T1 

EVs再次分析,从图可知分选后的样本并无严重的其他门内颗粒污染

生物纳米颗粒的高速分析和高活性分选(图8)

4. 细胞形态完整且具备功能性的EVs高速分选验证



EVs作为细胞间的媒介,是具备生物活性的颗粒,在细胞间传递信号分子影响细胞的生理代谢,所以如同我们常规流式分选一样,有些

老师分选后的细胞是活的但是由于分选后受损伤已无功能,无法完成后续实验,EVs同样如此,分选后的EVs是否具备有功能性的蛋白

和RNA Cargo至关重要


作者选取BaL(a CCR5-tropic HIV strain)和NL4.3(a CXCR4-tropic strain)两种病毒颗粒,选取的理由为这两种病毒借助不同

的共同受体实现宿主细胞的入侵以及靶细胞的感染,即Bal病毒只能感染具备CCR5受体的靶细胞,因此分选后的病毒颗粒去感染靶细

胞,该模型可以验证分选过程对病毒颗粒是否带来损伤,如果损伤则无法成功感染靶细胞


PKH26 (red) 标记的 BaL病毒颗粒和 PKH67 (green) 标记的NL4.3病毒颗粒等量混合后上流式,结果如下图,图a为散射光图上病毒

颗粒与背景噪音的清晰分群,图b上方为分选前的EVs,图b下方为分选后回测的EVs,图c为回测的纯度统计,纯度均高于94%


生物纳米颗粒的高速分析和高活性分选(图9)

下图绿色圈内分别为分选前和分选后电镜下的EVs,可见分选后的EVs形态完整,红色圈内为分选后的Bal病毒颗粒分别感染具备CCR5

受体的U373-MAGI-CCR5和CXCR4受体的 U373-MAGI-CXCR4 细胞,由于Bal病毒颗粒亲和受体为CCR5,所以可见红圈内上图CCR5

+细胞形成明显的蓝色β-Gal显色,表明分选的Bal病毒具备生物活性,分选过程并没有对病毒颗粒造成明显的损伤,同理见蓝色圈内的

NL4.3病毒颗粒成功感染CXCR4+细胞

生物纳米颗粒的高速分析和高活性分选(图10)


5. EVs表面的肿瘤和免疫细胞标志物检测



EVs作为一个异质性的群体,包括外泌体和细胞微泡,因此单个EVs水平的鉴定分类有助于更好的理解EVs,包括蛋白的表达以及EVs的来

源等。作者以PC3-pip 细胞系和bone marrow-derived dendritic cells (BMDCs)来源的EVs为研究对象,分别分析其表面前列腺癌特异

                                        性膜抗原(PSMA)和MHC II 抗原表达,其中The PC3-pip 细胞系被工程化改造表达PSMA抗原


下图的实验结果表明,PC3-pip-EV 和 BMDC-EV在488nm散射光 SSC上与背景噪音明显分群,同时FITC和PE标记的PSMA和MHCII,在

对应荧光通道均有荧光明显增强(注X轴的单位为Joshua A. Welsh模型下的荧光强度值转化为MESF值),说明EVs表面相关抗原的表达


生物纳米颗粒的高速分析和高活性分选(图11)

文章的讨论环节,作者认为其描述的nanoFACS方法学不同于其他学者描述的纳米级流式分析法,主要在以下几点

                                             1)即使荧光参数整合在nanoFACS中,但nanoFACS不需要以荧光作为阈值设置通道,凭借灵敏度更高的散射光参数作为阈值,可以更为完整

                                                  的分析和分选EVs中的不同亚群

                                             2)  传统流式由于散射光分辨率不够,需要借助微球吸附EVs,而nanoFACS不需要微球,依靠合适的 样本稀释以及仪器配置,即可将EVs单个

                                                  颗粒和背景噪音区分,相比于微球吸附EVs,nanoFACS更直接,也更有助于更好保留EVs的颗粒特性以及生物学功能

                                             3)nanoFACS具备高速分析和分选各类生物以及无机纳米颗粒的能力,且分选后的颗粒具备高度功能活性。同时据作者的了解,nanoFACS 是

                                                  第一次流式方法学上 验证了纳米颗粒的functional vesicular structure, protein和RNA

                                            4)nanoFACS 利用流式检测极限下的背景噪音作为阈值设置参考,有助于研究和评价散射光较弱的纳米颗粒,而这类颗粒在传统流式仪器上由于

                                                  无法与背景噪音有效分辨而无法被检测



流式分选是分析和鉴定生物颗粒(细胞或者EVs)的重要工具,最后,作者对自己提出的nanoFACS 提出了希望,希望nanoFACS方法学作为

将来研究exosomes, viruses, microvesicles, and other submicron biomaterials的有用工具




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